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鹿茸的化学成分及质量控制方法研究进展
Linnaeus）的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角；前者习称“花鹿茸”，后者习称“马鹿茸”。鹿茸其味甘、咸，性温；壮肾阳，益精血，强筋骨，调冲任，托疮毒。许多中国古医学著作均对其有详细的记载。《神农本草经》将其列为中品；《中华本草（藏药卷）》中记载：鹿茸生精补髓，补血，补肾
作为传统的名贵中药，鹿茸以其丰富的药理作用，已经被广泛使用了2000多年。梅花鹿与马鹿作为《中华人民共和国药典》（简称中国药典）鹿茸的来源品种，在我国分布广泛，其中梅花鹿分为6个亚种（东北亚种、四川亚种、华北亚种、华南亚种、山西亚种、台湾亚种）[4]，马鹿分为8个亚种（天山亚种、塔里木亚种、阿尔泰亚种、东北亚种、阿拉善亚种、甘肃亚种、四川亚种和西藏亚种）[5]，两者的东北亚种的道地产区为黑龙江与吉林，饲养量约占全国1/2。据统计，目前鹿茸全球生产量每年接近1 300吨[4]，从20世纪末开始，鹿茸在医疗保健用途上不断扩充，市场需求不断扩大[6]，据国家食品药品监督管理总局网统计，含鹿茸的中药就有13类，含鹿茸的保健品有65种，鹿茸资源供不应求，价格昂贵。四川、甘肃地方标准中还按照当地鹿茸的用药习惯规定白唇鹿、水鹿也可作为鹿茸药用[7-8]，导致了鹿茸基原的混乱；此外市场上还存在驯鹿茸、驼鹿茸等作为鹿茸销售，其中以驯鹿茸居多[9-10]。目前鹿茸质量参差不齐，等级混乱，以次充好的现象在市场销售中经常发生，严重影响了消费者用药的安全性和有效性。因此，本文就鹿茸的化学成分及质量控制方法等进行综述，以期为鹿茸的质量评价和更深层次的研究提供依据。
近年来，学者们不断深入地研究鹿茸化学成分，发现鹿茸中化学成分较多，且随生长周期的变化而呈较为规律的变化，其中氨基酸、多肽及甾体化合物等是鹿茸的主要活性物质。现对鹿茸中各种化学成分进行总结，见表 1。
氨基酸是鹿茸有机成分中含量最高的营养物质，其种类与含量决定着蛋白质品质的高低。鹿茸中所含氨基酸包括甘氨酸、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸等20种以上，总氨基酸含量约占50%以上，其中甘氨酸含量最高，谷氨酸、脯氨酸含量也较高[11-12]；其中包括人体不能合成的8种必需氨基酸，以赖氨酸含量较高，为人体第一限制性氨基酸[13]。有研究表明，由于鹿茸种类、生长环境、采收季节等情况的不同，氨基酸的种类虽无明显差异，但其含量差异却较为显著。如有研究报道，鹿茸腊片、粉片、血片和骨片各部位之间氨基酸含量依次降低，即从鹿茸顶端到基部氨基酸含量逐渐减少[14-15]，另有研究报道，三杈鹿茸中的氨基酸含量高于二杠鹿茸中氨基酸含量，推测可能与其采收期相关，二杠鹿茸在40 d时采收，很有可能因生长时间较短，营养富集不充分导致[16]。
鹿茸多肽（velvet antler polypeptide，VAP）是鹿茸主要的生物活性物质，药理作用广泛。每年鹿茸都要经过脱盘、生茸、骨化、脱落、再生茸的循环过程，具有极强的再生能力，这与鹿茸是一个富含高浓度多种类天然的细胞生长因子库密切相关，人们习惯上称为多肽生长因子[17]。有研究报道鹿茸中的多肽生长因子主要包括表皮生长因子（EGF）[18]、神经生长因子（NGF）[19-20]、（IGF）[21]和转化生长因子（TGF）[22-23]，在鹿茸生长过程中，多种生长因子的自分泌、旁分泌刺激作用，对鹿茸的生长极其重要。
另有研究报道，利用凝胶过滤、离子交换色谱及C18反相柱色谱等方法从不同的鹿茸中分离纯化得到一系列的单体多肽，单体多肽均富含甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸等[24-25]。如翁梁等[26]从东北马鹿茸多肽组分中分离得到1个由32个氨基酸残基组成（32肽）的精确分子量为3 216的单体多肽化合物，但在梅花鹿茸多肽组分中检测不到该32肽，说明该32肽有可能是马鹿茸特有的活性物质；张郑瑶等[27]从梅花鹿茸中分离得到1个新多肽，经MALDI-TOF MS给出该多肽的精确分子量为3 263.4，氨基酸序列为VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM，此梅花鹿茸多肽与上述马鹿茸多肽在结构上均为32个氨基酸残基组成的直链多肽，但第5、8、11和30位氨基酸残基不同。2个多肽结构上的变化并未影响其促细胞增殖生物活性。严铭铭等[28]从梅花鹿鹿茸中得到1个相对分子质量为1 479.902 8的单体多肽CNT14，用电喷雾串联质谱法测序结果为EPTVLDEVCLAHGP。该多肽对HT22细胞株具有明显的增殖作用，这预示着此多肽在治疗阿尔茨海默病方面具有一定前景。
鹿茸中蛋白质包括胶原蛋白、角蛋白等[29]，有研究报道胶原蛋白是鹿茸中含量最高的蛋白质[30]，其含量在鹿茸顶部最低，从顶端到基部逐渐增加[15]。胶原蛋白肽链很长的区段序列是由Gly-X-Y氨基酸序列重复而成的，甘氨酸的含量高低反映了胶原蛋白丰富程度[31]。
鹿茸含有性激素和激素样物质等甾体类化合物，与其生长及其壮肾阳等药理作用密切相关。目前，已检测出鹿茸中含有18种性激素，包括雌二醇、雌三醇、雌酮、雄酮、苯甲酸雌二醇、炔雌醇、孕酮、睾酮、丙酸睾丸素、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮、肾上腺酮等[32-33]。鹿茸的性激素成分中，雌激素和孕激素含量较高，如雌二醇、孕酮[34]、雌酮；雄激素含量较低，如睾酮、睾丸素等。有研究表明，雌二醇和睾丸酮这2种性激素与鹿茸的生长关系尤为密切[35-36]。
鹿茸中的无机元素含量与氨基酸含量相比，从鹿茸顶部到基部，无机元素的含量逐渐增加[11]，目前在鹿茸中已发现26种矿物质元素，一些是酶、辅酶、激素和维生素的必需组成部分[37]。据报道，鹿茸所含矿物质元素中，常量元素包括Ca、P、Mg、Na；而微量元素包括Fe、Cu、Mn、Al、Ba、Co、Sr、Cr、Zn、Ni等[38]，其中Fe、Cu、Co、Zn、Cr为必需微量元素。有研究报道不同品种鹿茸中Ca、P、Na可作为鹿茸的特征无机元素，Fe、Ba、Sr可作为鹿茸的特征微量元素[31]，其中Ca和P的含量差异最大，钙磷比一度成为衡量鹿茸骨化程度的重要指标[39]。
除了蛋白质、多肽、氨基酸及甾体化合物外，单胺[40]、多胺[41]、多糖[42]、脂肪酸[43-44]、磷脂[45-46]、生物碱类[47-48]、胆固醇及其脂类[21,49]等在鹿茸的生长发育过程中也具有广泛的药理作用。
鹿茸作为我国传统名贵中药材，近年来发展迅速，使得药材及产品的质量出现了参差不齐的现象，不法商家为谋取利息，以假乱真，以次充好，从而导致了市场的混乱，因此为保证鹿茸用药的准确、有效，还需不断完善和提高鹿茸的质量控制及评价体系。
根据对历年版中国药典及标准的整理（见表 2），发现对鹿茸的质量控制方面还有相当大的提升空间，有的地方标准收载的鹿茸的基原与中国药典还存在一定的差异，导致市场鹿茸基原的混乱及质量评价的不一致，不规范，这些问题都有待进一步的完善与解决。
目前随着物理、化学、分子生物学技术等多学科已广泛地应用于食品、药品和医学各个领域，研究人员对鹿茸的真伪鉴别以及质量评价研究不断深入。除了中国药典及地方标准规定的鉴别方法外，很多研究者根据工作中遇到的问题和社会生产的需要，研究开发了不同的鉴别方法，在深度和广度方面都有了明显的进步。主要以紫外分光光度法、红外光谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用、指纹图谱分析、气相色谱法、气相色谱-质谱联用及分子生物学为技术支撑，进行鹿茸药材的质量评价。
紫外分光光度法在鹿茸药材的质量控制研究中，目前主要存在2种情况：一种是根据样品的吸收光谱特征，来判断鹿茸的真伪优劣。有文献报道，花鹿茸、马鹿茸、鹿茸片在（253±2）nm、（238±2）nm处分别有最大吸收和最小吸收；而鹿茸粉在250~260 nm处有平滑肩峰；鹿茸骨化部分既无最大吸收，也无最小吸收[60-62]；该方法尚待大量样品的验证。另一种则是以鹿茸药材或鹿茸制剂中某种成分含量的高低作为鹿茸质量控制的定量分析方法，即选择某一对照品建立标准曲线，在特定波长处，测定供试品溶液的吸收度，进而计算样品中某类成分的含量[63-65]。白珺[65]等以甘氨酸为指标性成分，在570 nm下测定鹿茸普通细粉与超微粉中总氨基酸的含量，结果显示二者差异不大。紫外分光光度法体现的待测成分的官能团信息，无法达到很高的专属性。
红外吸收光谱法在鹿茸样品的分析测定中，根据红外光谱图中倍频峰[66]、合频峰[66]、特征吸收峰[67-68]的差异以及有无来推测鹿茸药材中所含化学成分的异同及含量的差异，进而为鹿茸的质量控制提供依据；还有研究根据鹿茸片红外光谱图中特征峰（1 651±2）cm-1与（1041±26）cm-1峰高的比值“Z”值，确定“Z”值大的比“Z”值小的质量好（符合传统鹿茸片质量等级的划分），即“Z”值（一等鹿茸片）大于“Z”值（二等鹿茸片），建立了一个客观可比的指标来判断鹿茸片及鹿茸粉的质量等级[69]。
毛建江等[66]通过欧氏距离法分析样品的近红外光谱图的差异，从而对鹿茸样品进行定性分析，即根据已知样品的谱图建立鉴别库，以此分析未知样品。结果显示不同产地、不同种类的鹿茸（13类，包括花鹿茸、马鹿茸、赤鹿茸、驯鹿茸）几乎全部归类，鉴别准确，识别率较高，为鹿茸样品的聚类分析提供了参考依据，但是该方法依赖于鉴别库中样品的代表性与多样性，需要通过增加样品的数量来提高鉴别成功率。唐慧英等[67-68]根据傅立叶红外光谱法（FTIR法）分析3种质量等级的鹿茸，根据油脂类化合物及糖类化合物峰高及峰强的变化规律，推测鹿茸中脂肪类化合物含量：一等品含量 二等品含量 三等品含量；推测鹿茸中糖类含量：二等品含量 一等品含量 三等品含量。说明不同质量等级的鹿茸虽然所含化学成分相同，但含量还是有所区别；此外，将FTIR与二阶导数相结合，进一步增强了特征吸收峰的分辨率，可以更好地表征鹿茸商品等级的差异，通过对蛋白质、氨基酸（1 650，1 540 cm-1）、多糖（1 035 cm-1）和油脂（2 926，2 855，1 746 cm-1）等主要成分的吸收峰的分析可知，鹿茸中各有效成分含量：一等品含量 二等品含量 三等品含量；但此法仅可以作为初步、快速的分析方法，要具体解决鹿茸的质量评价，还需更深入的研究。
鹿茸薄层鉴别方法自1990年开始收载于中国药典中，药典中仅以甘氨酸为对照，对鹿茸中所含氨基酸进行质量控制。随着鹿茸质量控制研究方法的深入，研究者尝试使用不同的展开剂，以不同的化学成分为分析指标，分析不同规格的鹿茸药材，如蜡片、粉片、砂片、骨片、鹿茸粉、鹿茸饮片、蜡片伪制品，以期得到更加丰富的化学成分信息，为鹿茸样品的质量控制提供更多的参考；此外薄层鉴别还用于含鹿茸的中成药进行定性鉴别[70]。
叶志龙等[71]以苯酚-0.5%硼砂（4:1）为展开剂对鹿茸岭南特色饮片中氨基酸成分进行定性和半定量研究，结果显示比采用中国药典规定的正丁醇-冰醋酸-水（3:1:1）条件多4个斑点，提供的信息更加丰富，鹿茸薄片与鹿茸片的斑点数一致，说明它们的氨基酸种类基本一致，但鹿茸薄片斑点颜色偏浅，说明其含量相对较低。徐志红等[72]利用薄层色谱分离鹿茸超临界流体萃取物，鉴定出卵磷脂（PC）、脑磷脂（PE）、溶血卵磷脂（LPC）、溶血脑磷脂（LPE）、神经鞘磷脂（SPH）5种磷脂。段传风等[73]以三氯甲烷-甲醇-乙酸-乙醇-水（25:4:6:3:0.5）为展开剂，利用单向薄层色谱法对梅花鹿茸中的10种磷脂组分进行分离，以10%磷钼酸乙醇液为显色剂，在同一色谱条件下用标准磷脂定性，此外以Dittmer特定的磷脂显色剂显色，并用薄层色谱扫描测定磷脂成分的含量。
高效液相色谱法以其简便、快速、灵敏、准确等特点，在鹿茸药材的定性、定量的质量控制中非常重要。据研究报道，鹿茸中的大部分成分均可使用高效液相色谱法进行测定，如生物碱（尿嘧啶、尿苷、次黄嘌呤）[47,74-76，84]、多胺类（腐胺、精胺、精脒）[77]、氨基酸[71,78]、水溶性总蛋白[79]等。其中以氨基酸成分为分析指标进行鹿茸的质量控制时，针对氨基酸成分几乎无紫外吸收和荧光发射特性，建立鹿茸的柱前衍生化高效液相色谱法，即在鹿茸样品的处理过程中，加入衍生化试剂，使氨基酸成分具有紫外吸收，可在一般的UVD上进行检测。研究报道中所使用的衍生化试剂有苯甲酰氯[77]、2，4-二硝基氟苯[71,78]、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）[39]等。
鹿茸中化学成分复杂，经查阅文献，目前鹿茸的含量测定的相关研究见表 3，但是以常规的单一成分或某几种指标成分的含量作为鹿茸的质量评价标准具有局限性，而中药材指纹图谱模式则能够提供全面而整体的质量评价信息。目前已有文献报道的鹿茸的指纹特征图谱主要对不同规格[71,78]、不同产地[80]、不同部位[76]的梅花鹿进行质量评价，此外还可以进行梅花鹿与马鹿的品种鉴别[98]。指纹图谱法在鹿茸质量控制中的应用见表 4。
气相色谱法主要用于分离分析易挥发的物质，此法具有简便、快速、高灵敏度、高选择性等特点；在鹿茸的质量分析中主要用于脂肪酸[73,99]、胆固醇[100]、性激素[33,101]的检测。
段传凤等[73]用三氟化硼甲醇对花鹿茸膜脂快速酯化，利用气相色谱法根据已知脂肪酸甲酯样品的保留值，对花鹿茸中的10个脂肪酸组分进行了定性分析，再用面积归一化法对所含脂肪酸进行定量分析；另有研究报道，高其品等[99]利用气相色谱法对鹿茸胶中的4个磷脂的脂肪酸侧链的脂肪酸种类差异和百分含量进行了测定，结果表明鹿茸精的制备工艺应该改进，以便将鹿茸中的鹿茸精部分提取完全。
芦春梅等[101]采用固相萃取技术对鹿茸及相关产品进行前处理，并采用七氟丁酸酐对萃取物进行衍生化，采用GC-MS/MS对市场上常见8种鹿茸保健品中的11个性激素进行了定性及定量检测，提高了检测方法的灵敏度和选择性；结果显示，只有2种保健品中检出性激素，且含量较低，说明此法可用于保健品中激素水平和含量的检测，并且同时说明了市场上所售鹿茸保健品在激素方面的保健作用较小。另有研究报道，芦春梅等[33]应用同样的方法对从3个国家搜集的鹿茸样品中的18个类固醇激素进行了同时检测，结果显示不同样品中激素种类及含量均存在差异。
目前，随着科学技术的发展及不同学科的交叉应用，中药材的质量控制方法也呈现多元化、多样性。除了传统的鉴别方法外，分子生物学技术在中药材的质量控制中的应用也越来越广泛，在鹿类药材的鉴定研究中也有不少报道，如DNA条形码技术（常用引物为LCO1490和HCO2198）[10,102-103]、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）鉴定法[104-106]、限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）基因鉴定法[107]、随机扩增DNA多态性（RAPD）指纹图谱技术[9,108]及高分辨率熔解曲线]等，所使用到的电泳分析技术既有传统的琼脂糖凝胶电泳[108]，也有高效毛细管电泳[9]。DNA条形码技术可用于鹿茸药材及饮片的基原鉴定，还可用于鉴定鹿茸粉存在混合物或掺伪的现象。有研究报道，利用DNA条形码技术对收集到的市售的鹿茸粉进行基原鉴别，结果显示以驯鹿茸为主；其中混合粉以马鹿茸和花鹿茸为主要成分，总体结果表明鹿茸粉存在原料基原不准，品种不纯，混合掺伪等问题
103]。张学维等[107]利用特异性PCR和PCR-RFLP鉴定法研究马鹿各亚种的区别，使用CEYS：5′-CCCAAACAAAACTATTCGCC-3′与CEYA：5′-GGGATAACTTTCGTGCTG-3′这1对引物对提取的DNA进行扩增，结果显示只有塔里木马鹿茸的模板可得到约300 bp的阳性条带，而东北马鹿与天山马鹿无法得到扩增条带；此外，PCR-RFLP结果显示，只有塔里木马鹿的12S rRNA片断可以被切开呈350 bp和90 bp的2个片段，二者的结合可有效、准确地用于区分塔里木马鹿和其他马鹿亚种，从而建立塔里木马鹿茸的基因鉴定方法。陈康等[109]将DNA条形码技术与高分辨熔解曲线（high resolution melting，HRM）技术相结合，通过比对鹿茸药材DNA扩增熔解曲线的峰形和DNA双链解链50%的温度（Tm）位置来鉴别鹿茸药材真伪，研究结果显示正品鹿茸熔解曲线均显示双峰，但Tm值差异较大；驯鹿茸熔解曲线显示单峰，白唇鹿熔解曲线显示双峰，但两峰未分开，此法可用于鹿茸药材及其混伪品的快速检测。3 总结
综上所述，鹿茸的化学成分复杂多样，包括20多种氨基酸，总氨基酸含量约占50%以上；5种多肽生长因子，对鹿茸的循环再生非常重要；18种甾体化合物，其中雌二醇与睾丸酮与其生长关系尤为密切；26种矿物质元素，其中钙磷比一度成为衡量鹿茸骨化程度的重要指标；此外还包括生物碱、生物胺、多糖、脂肪酸、磷脂、胆固醇等化学成分。
鹿茸的真伪鉴别，前期采用性状鉴别和显微鉴别，进行初步判断；进一步以甘氨酸为对照，采用薄层色谱鉴别、紫外分光光度法进行判断；为提高准确度，基于不同物种的基因不同，联合使用多种DNA分子生物学鉴定技术进行鹿茸基原的鉴定，但此法成本较高，有待推广。
鹿茸及其相关产品的质量评价，根据不同的指标成分，采用包括薄层色谱法、紫外分光光度法、红外光谱法、高效液相色谱法、气相色谱法等方法为研究鹿茸质量标准提供参考，但它们在鹿茸的质量等级区分上尚有待于进行更深入的方法学研究和大量样品验证。其中蛋白质、氨基酸、多肽以及矿物质元素等随生长周期的变化而呈较为规律的变化；此外民间以酒泡鹿茸饮之，有研究表明，采用含醇的水提取时，溶出的成分较多，影响对单胺氧化酶（MAO）的抑制作用